طراحی وساخت منبع یونیزاسیون الکترواسپری تقویت شده با گاز مه پاشی (یون اسپری)با هدف آنالیز کمی مستقیم پروتئین ها به روش اسپکترومتری تحرک یونی

در این پایان نامه برای اولین بار آنالیز کمی پروتئین ها بدون تبدیل آن ها به پپتید به روش اسپکترومتری تحرک یونی معرفی می شود. همچنین منبع یونیزاسیون یون اسپری (الکترواسپری تقویت شده با گاز مه پاشی) جهت استفاده در اسپکترومتر تحرک یونی طراحی و ساخته شد. در مطالعات پروتئومیکس، پس از شناسایی پروتئین ها اندازه گیری غلظت آن ها بسیار حائز اهمیت است. دو روش عمده برای آنالیز کمی پروتئین ها وجود دارد. یک روش، آنالیز پروتئین به صورت اصلی (بدون تبدیل به پپتید) و روش دیگر هضم پروتئین به پپتیدهای سازنده ی آن و سپس اندازه گیری آن ها است. در این پایان نامه، روش اول برای آنالیز کمی پروتئین انسولین با وزن مولکولی نسبتاً کم (حدود6000 دالتون) و پروتئین آلبومین به دو فرم سرم آلبومین گاوی و سرم آلبومین انسانی با وزن مولکولی بالا (حدود67000 دالتون) مورد استفاده قرار گرفت. به همین منظور سیستم یونیزاسیون الکترواسپری تقویت شده با گاز مه پاشی (یون اسپری) برای دستگاه طیف سنج تحرک یونی طراحی و ساخته شد. پارامترهای سرعت جریان فاز متحرک و سرعت جریان گاز مه پاشی برای کسب بالاترین پاسخ دستگاه (حساسیت) بهینه گردید. در آنالیز هر یک از این پروتئین ها از مخلوطی از آب ومتانول (1:1) به عنوان حلال و فاز متحرک استفاده شد و سپس ph هر یک از محلول ها با استفاده از استیک اسید تا حدود 1واحد زیر ph ایزوالکتریک پروتئین ها کاهش یافت تا علاوه بر انحلال بهتر، قابلیت آنالیز در مد مثبت طیف سنج تحرک یونی را داشته باشد. ابتدا انسولین مورد آنالیز قرار گرفت. طیف تحرک یونی حاصل از دستگاه طیف سنج تحرک یونی با منبع یونیزاسیون الکترواسپری و یون اسپری مقایسه شد که به خوبی نشان دهنده اثر گاز مه پاشی در سیستم یون اسپری بر شدت سیگنال هااست. علت این افزایش قابل توجه، تشکیل آئروسل های بسیار ریز از کلاسترهای درشت حاصل از پروتئین به همراه حلال در حضور گاز مه پاشی نیتروژن است. حضور یون های باردار چندگانه توسط مقایسه با طیف دو بعدی جرمی وتحرک یونی ارائه شده در مقالات به اثبات رسید. مقادیر تحرک کاهش یافته حاصل شده در مورد انسولین حضور حالت های باردار 3+،4+،5+ را تأیید می کند که ناشی از حضور آمینواسیدهایی با قابلیت پروتونه شدن در پروتئین انسولین است. سپس آنالیز کمی انسولین تحت شرایط بهینه یون اسپری انجام گرفت. در هر آنالیز طیف تحرک یونی از لحظه ظهور تا لحظه محو شدن ثبت گردید. سپس توسط نرم افزار مطلب میانگین گیری از طیف ها به عمل آمد، اصلاح زمینه انجام شد و انتگرال سطح زیر این پیک به عنوان پاسخ دستگاه ثبت گردید. در مورد انسولین گستره خطی 13- 2/0 میکرومولار و حد تشخیص 05/0 میکرو مولار به دست آمد. دو پروتئین دیگر نیز به همین صورت مورد آنالیز قرار گرفتند. اثر گاز مه پاشی در مورد این دو پروتئین که وزن مولکولی بالاتری دارند، بارزتر بود. در مورد سرم آلبومین گاوی گستره خطی 5/1- 075/0 میکرومولار و حد تشخیص 02/0 میکرومولار و در مورد سرم آلبومین انسانی گستره خطی 5/1-03/0 میکرومولار و حد تشخیص 009/0 میکرومولار به دست آمد. با توجه به نتایج ارائه شده می توان انتظار داشت که این شیوه آنالیز پروتئین با مزیت سادگی، پاسخ دهی سریع، حد تشخیص و گستره خطی مناسب، برای آنالیز کمی پروتئین های نشانگر بیماری در سیالات بیولوژیکی مورد استفاده قرار گیرد.